Kako je tema aktualna kopiram...

Zamrzavanje humanih gameta i zametaka

Pohrana spermija na jedan duži vremenski period uz zadržavanje njihove funkcionalnosti ima primjenu u obradi muške neplodnosti. Ljudski spermiji spadaju među prve žive stanice na kojima su proučavani utjecaji zamrzavanja i odmrzavanja. Već je 1776. godine Spallanzani otkrio da humani spermiji mogu preživjeti kratkotrajno izlaganje temperaturama blizu zamrzavanja. Pokušaji da se unaprijedi zamrzavanje spermija i omogući njihova kasnija uporaba bili su bezuspješni sve do 1949. godine i otkrića glicerola kao krioprotektivnog medija. Bunge i Sherman su 1953. godine izvjestili o prvoj uspješnoj oplodnji i trudnoći sa zamrznutim humanim spermijima. Od tada pa do danas, metode zamrzavanja i odmrzavanja spermija su usavršavane s ciljem pronalaska biokemijskog okoliša i fizikalnih uvjeta prikladnih za zamrzavanje spermija.

Postupci zamrzavanja i odmrzavanja sjemena dovode do smanjenja udjela pokretnih spermija i do slabljenja oplodne sposobnosti. Nekoliko je štetnih faktora koji djeluju na stanice spermija tijekom zamrzavanja: termalni šok, stvaranje kristalića leda, dehidracija, povećana koncentracija soli nakon što se zamrzne voda, te osmotski šok.

Do danas je na području zamrzavanja humanih spermija učinjeno jako puno otkrićem korisnih efekata krioprotektivnih supstanci. Krioprotektor je otopina koja se dodaje sjemenu u svrhu zaštite stanica spermija od dehidracije i zaštite staničnih proteina od termalne destrukcije pri zamrzavanju. Dodatna uloga krioprotektora je održavanje stabilnog pH. Glicerol je najčešće upotrebljavani krioprotektor za humane spermije, a u uporabi je još i DMSO (dimetil sulfoksid).

Ekstenderi su složene otopine koje također imaju krioprotektivnu funkciju. S ciljem poboljšanja ponovne funkcionalnosti spermija nakon procesa zamrzavanja i odmrzavanja koriste se mnogi složeni krioprotektivni puferski sistemi od kojih su HSPM (Human Sperm Preservation Medium) i TEST-yolk najčešće u uporabi. HSPM je modificiran Tyrodeov medij s konačnom koncentracijom glicerola od 15%, a TEST-yolku se glicerol dodaje u konačnoj koncentraciji od 10%. Krioprotektivni mediji se do uporabe drže zamrznuti na -20°C. Odmrznuti krioprotektivni mediji se dodaju nativnom ejakulatu kap po kap sve dok se ne postigne razrjeđenje 1:1. Nakon toga se uzorak prebacuje u sterilne slamčice (0,5 ml) ili ampule (1,8 ml) za zamrzavanje. Uzorci se mogu zamrzavati naglo u tekućem dušiku ili polagano pomoću programiranih bioloških zamrzivača, nakon čega se pohranjuju u posudama s tekućim dušikom na -196°C

Zamrznuti spermiji pružaju pacijentu mogućnost kasnijih postupaka inseminacija ili IVF-a. Zamrzavanje spermija je od neprocjenjive važnosti za pacijente koji trebaju proći kirurške operacije reprodukcijskog sistema, te za pacijente prije započinjanja kemoterapije ili radijacijske terapije, a koje u pacijenta potencijalno mogu prouzročiti neplodnost. Također se sjeme muškog partnera, bračnog para koji se nalazi u postupku IVF, zamrzava iz razloga ako se muški partner u vrijeme postupka IVF nalazi izvan države, ili ima teškoće s davanjem uzorka sjemena u prikladno vrijeme. U takvim slučajevima uzorak sjemena se zamrzava, te drži pohranjen u tekućem dušiku do dana aspiracije jajnih stanica supruge. U posljednjih desetak godina liječenje muške neplodnosti je znatno uznapredovalo uvođenjem tehnike intracitoplazmatske injekcije spermija u jajnu stanicu. Budući je za ovu tehniku potreban jedan jedini spermij, ICSI je zajedno s tehnikama mikrokirurške aspiracije spermija iz epididimisa (MESA – Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration), perkutane aspiracije spermija iz epididimisa (PESA - Percutaneous Sperm Aspiration), te izolacije spermija iz tkiva testisa (TESE - Testicular Sperm Extraction) koje za vađenje i izolaciju spermija koriste testis ili pasjemenik omogućio liječenje neplodnih pacijenata koji nemaju spermija u ejakulatu (azoospermia). Ovisno o nalazu nakon tih zahvata se provodi kriopohrana spermija ili tkiva testisa, tako da imamo mogućnost za više ICSI postupaka.

Zamrzavanje humanih zametaka je postalo važan dio programa oplodnje uz medicinsku pomoć u tretmanu neplodnog bračnog para. Humani zameci se čuvaju zamrznuti u tekućem dušiku na -196°C. Tijekom zamrzavanja, sve kemijske reakcije unutar stanice moraju biti zaustavljene. Oštećenje zametaka se dešava tijekom procesa hlađenja i otapanja, a kao rezultat stvaranja kristalića leda unutar stanica, ili promjene osmotskog pritiska kao posljedica dehidracije stanice. Sporo programirano hlađenje kao i upotreba krioprotektora (propanediol, dimetil sulfoksid ili glicerol) ograničava oštećenja zametaka tijekom zamrzavanja. Povećan broj zametaka kao rezultat in vitro oplodnje može biti uspješno sačuvan za kasnije pokušaje oplodnje. Na taj način se izbjegavaju medicinski i socijalni problemi povezani s višestrukim trudnoćama, omogučujući da se u odgovarajućem ciklusu prenese samo manji broj zametaka. Na taj način se i povećava mogućnost trudnoće iz svakog pojedinog ciklusa in vitro fertilizacije. Zamrzavanje zametaka je važno i da bi se izbjegao sindrom hiperstimulacije jajnika, budući se svi zameci mogu zamrznuti do prijenosa u uterus u narednom ciklusu. Iako se zamrzavanje zametaka provodi uspješno, mnoga etička i pravna pitanja su ostala neriješena po tom pitanju (npr. ako se bračni par razvede ili partner umre).

Zamrzavanje humanih oocita je mnogo zahtjevnije budući je potrebno da stanica preživi, ali i da zadrži potencijal oplodnje. Kada je stanica izložena niskim temperaturama citoplazmatska tekućina se zamrzava što rezultira s dvije štetne posljedice: unutarstaničnoj kristalizaciji i dehidraciji. Dok unutarstanični kristali mehanički oštećuju organele i membrane, unutarstanična dehidracija uzrokuje povećanu osmolarnost. Zbog toga se tijekom zamrzavanja koriste krioprotektori koji sprečavaju unutarstaničnu kristalizaciju i dehidraciju. Razlozi zbog kojih je slaba uspješnost trudnoća iz krioprezerviranih oocita su štetne promjene koje se tijekom zamrzavanja dešavaju u mejotskom diobenom vretenu, zoni pellucidi, staničnoj membrani i citoplazmi oocite, a koje mogu spriječiti dovršenje oplodnje ili rezultirati u aneuploidnom zametku. Zona pellucida tijekom zamrzavanja postaje stvrdnuta, vjerojatno kao rezultat prerane egzocitoze kortikalnih granula što sprečava penetraciju spermija i onemogućuje izlijeganje zametka.

Alternativna strategija je zamrzavanje nezrelih oocita u stadiju germinalnih vezikula (diploten profaze) koje mogu maturirati i fertilizirati in vitro. Krioprezervacijom oocita u stadiju germinalnih vezikula mogu se zaobići neki od potencijalnih problema koji se javljaju tijekom zamrzavanja preovulacijskih oocita. Budući da ne posjeduju diobeno vreteno predstavljaju manji rizik za citogenetske greške tijekom diobe. Međutim, rizik oštećenja zone pellucide i dalje postoji tijekom zamrzavanja i otapanja. Dodatna prepreka za oplodnju oocita u stadiju germinalnih vezikula je njihovo slabo sazrijevanje in vitro.

Krioprezervacija primordijalnih folikula je potencijalno bolja zato što ima zametnih stanica u većoj količini, manje su diferencirane i metabolički aktivne, a i njihova mala veličina pridonosi manjoj osjetljivosti na nepovoljan utjecaj pohrane na niskim temperaturama. Stanice se nalaze u profazi i teoretski nose manji rizik citogenetskih greški od stanica u kasnijim fazama, međutim teško ih je izolirati, a i nema garancije da će one dostići funkcionalnu zrelost.

Slabi rezultati postignuti zamrzavanjem humanih oocita (do danas je tek nekoliko djece rođeno iz zamrznutih oocita) i etičke dileme koje su povezane sa zamrznutim zamecima dovele su do zanimanja za pohranom tkiva jajnika kod pacijentica s ciljem očuvanja njihove plodnosti. Potrebno je provesti dodatna istraživanja da bi se ustanovio najoptimalniji protokol za zamrzavanje tkiva jajnika.


Preuzeto:
http://kutak.forumotion.com/iuiivfic...si-aha-t88.htm